鸡白血病多重PCR和斑点杂交检测_老木一支笔专业编制可行性研究分析报告_资金项目立项申请报告

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鸡白血病多重PCR和斑点杂交检测

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1　范围
本标准规定了我省针对禽白血病的诊断检测技术的方法。
本标准适用于企、事业单位禽病诊断实验ALV-A/B和ALV-J的检测,判断鸡群是否患A/B、J亚群白血病检测。
2　规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 26436 禽白血病诊断技术
NY/T 680 禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验
3　术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1　
禽白血病 Avian Leukosis，AL
反转录病毒科甲型反转录病毒属禽反转录病毒引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的可传染的肿瘤性疾病，临床症状主要表现为嗜睡、食欲不振、鸡体消瘦、鸡冠和肉髯呈淡紫色，腹部显著增大，胸骨异常隆起。根据病毒囊膜蛋白的抗原性差异、病毒干扰实验、宿主范围等生物学特性，将禽白血病肉瘤病毒群分成A-J共10个亚群，其中A、B、C、D、E和J亚群的宿主是鸡，流行于我国禽群的主要是A、B和J亚群。ALV-J的危害最为严重，目前在鸡群中平均感染率为10 %左右，呈现间歇性爆发；ALV-A/B零星爆发，平均感染率在1 %左右。J亚群主要诱发髓细胞性白血病，而A/B亚群主要造成淋巴细胞性白血病和肉瘤。禽白血病自发现以来，发病率不断呈上升趋势，在世界各地均有发生，呈世界性分布，是危害养禽业的主要疾病之一。
3.2　
多重PCR技术 Multiple polymerase chain reaction，M-PCR
在普通PCR的基础上加以改进,于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。
3.3　
斑点分子杂交技术 dot blotting
是直接从待检鸡只的组织或血液样品提取DNA, 将变性的DNA样品点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后与制备的特异性探针进行杂交来检测样品中的前病毒DNA。
4　试剂或材料
除另有规定外，所有化学试剂均为分析纯。
4.1　常规使用的商品化的DNA提取试剂盒。
4.2　常规使用的商品化的RNA提取试剂盒。
4.3　LB培养基所需胰蛋白胨（Rryptone）、酵母抽提物（Yeast Extract）试剂。
4.4　Multi Hotstart DNA Polymerase(5 U/μL)、10×Multi Hotstart Buffer(+Mg2+)、Mgcl2（25 Mm）、Super Pure dNTP(2.5 Mm each)、PCR琼脂糖凝胶回收试剂盒、RNA prep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒。
4.5　DL 1000 DNA Marker、PMD 18-T载体、6×loading Buffer、PrimeScriptTMRT Master Mix。
4.6　禽白血病抗原检测试剂盒。
4.7　斑点杂交所需溶液。
4.7.1　1 M马来酸：见附录A中A.1。
4.7.2　洗涤缓冲液(马来酸缓冲液)：见附录A中A.2。
4.7.3　显色缓冲液：见附录A中A.3。
4.7.4　l M Tris-盐酸溶液：见附录A中A.4。
4.7.5　10 % SDS（sodium dodecyl sulfate）溶液：见附录A中A.5。
4.7.6　20×SSC（saline sodium citrate）溶液：见附录A中A.6。
4.7.7　封闭溶液（Blocking溶液）：见附录A中A.7。
4.7.8　抗体溶液：见附录A中A.8。
4.7.9　预杂交溶液：见附录A中A.9。
4.7.10　杂交溶液：见附录A中A.10。
4.7.11　NBT/BCIP显色液：见附录A中A.11。
4.7.12　探针标记和检测试剂盒（使用Roche公司产品）。
4.7.13　制备探针所需特异性引物序列：见附录B。
4.7.14　PT-PCR扩增条件见附录C。
5　仪器设备
5.1　各量程移液枪，PCR仪，梯度PCR仪，紫外分光光度计。
5.2　高速台式冷冻离心机。
5.3　紫外分析仪。
5.4　凝胶成像系统。
5.5　MK3型酶标仪。
5.6　恒温摇床。
5.7　恒温恒湿箱、立式压力蒸汽灭菌器、超净工作台。
5.8　双稳定时电泳仪、核酸电泳槽。
5.9　超声波细胞粉碎机。
5.10　数显超纯水机。
5.11　全自动雪花制冰机
5.12　数显恒温水浴锅。
5.13　电热恒温鼓风干燥箱。
5.14　Heal Force 二氧化碳培养箱。
5.15　pH计。
5.16　恒温磁力搅拌器。
5.17　三洋超低温保存箱。
5.18　高压灭菌器。
5.19　硝酸纤维素膜或尼龙膜。
5.20　冰箱。
6　样品采集
6.1　组织样品
该病主侵器官是肝、脾、肾，采集组织样品时，主要采集肝脏、脾脏、肾脏，同时应采取有明显病变与健康交界处的组织。用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品装入冻存管，编号，迅速放入液氮罐中或送实验室-80 ℃冰箱备用。
6.2　样品储运
样品采集后，将采集的样品放入编号的冻存管中，迅速投入液氮罐中或置于冰盒中，密封，送实验室冻存备用。
6.3　样品存放
样本采集后迅速放入液氮罐中，若需长期保存应放在-80 ℃冰箱，但应避免反复冻融。
7　操作方法
7.1　方法概要
7.1.1　多重PCR
基于ALV-A、ALV-J的保守性基因，合成了特异性引物（见附录D），从混合病毒中，提取了混合病毒的RNA并逆转录为cDNA，运用多重RT-PCR技术扩增出545 bp(ALV-J)、692 bp(ALV-A)的特异性片段。
7.1.1.1　ALV-A、ALV-J的扩增
将复苏后的DF-1细胞进行传代25 cm2的培养瓶，4 h后取保存于-80 ℃的病毒液，经0.22 μm滤器过滤除菌，接种1.5 mL于细胞，1 h后弃病毒液，加入5 mL的PBS清洗后，再加入1 %的DMEM培养基维持7 d，7 d后收集细胞上清即为扩增的病毒液。
7.1.1.2　接毒培养细胞总RNA的提取
培养7 d后的细胞吸弃上清后，按照1 mL每瓶（以覆盖细胞瓶底壁为参考）25 %胰酶进行消化30 s，倒弃胰酶后加入PBS 5 mL清洗细胞，移入离心管后按照1006.2×g离心2 min。将分离的细胞用商品化试剂盒提取RNA，并反转录成cDNA，保存于-80 ℃超低温冰箱中。
7.1.1.3　总RNA的逆转录反应
先去除RNA中的DNA：5×gDNA Eraser Buffer 2µL，gDNA Eraser 1µL，总RNA 1µg, 加无RNAse双蒸水至10µL，42℃ 2 min；然后进行RNA的逆转录：在以上的液体中加 5×PrimeScriptTMRT Master Mix 2µL,加无RNAse双蒸水至20µL，混匀后，37℃反应15min，85℃ 5S，然后置于4℃。
7.1.1.4　多重RT-PCT体系
见附录E。
7.1.1.5　PCR反应后以1.5 %琼脂糖凝胶电泳进行分析
7.1.2　斑点杂交
准备好自制的特异性探针，提取样品DNA，将变性的DNA样品点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后与制备的特异性探针进行杂交，通过观察出现的斑点来检测样品中的前病毒DNA。
7.1.2.1　样品DNA的制备
按照DNA提取试剂盒说明书的方法，提取DNA，并于4 ℃保存备用。
7.1.2.2　探针目的基因设计与合成
用 DNAStar 软件设计通用探针和各亚群探针的目的基因，送生物技术有限公司合成ALV p27部分基因和ALV-J env部分基因作为探针目的基因。
7.1.2.3　核酸探针标记
a) 按照地高辛标记试剂盒的说明书对上述回收的通用探针基因片断和各亚群探针基因片段进行标记。在 Eppenderf 管中，加 1 µgDNA 模板，高压灭菌双蒸水至 16 µL；
b) 沸腾水浴变性 10 min，迅速冰浴 2 min, 充分变性有利于标记；
c) 将混合地高辛引物 4 µL，至变性的 DNA 中，离心 313×g；
d) 孵化 37 ℃，24 h，时间延长会增加标记产物；
e) 加 2 µL 0.2 M EDTA(pH=0.8)终止反应。
7.1.2.4　探针标记效率的检测
a) 分别从 2～9 管（标记探针）和标记阴性探针对照中取 1 µL 到尼龙膜；
b) 固定核酸到膜上（烤箱 120℃，30 min）；
c) 把尼龙膜转移到 20 mL 马来酸缓冲液里面，摇晃 2 min；
d) 10 mL 封闭液孵育 30 min；
e) 10 mL一抗孵育 30 min；
f) 10 mL洗涤液冲洗 15 min×2 次；
g) 10 mL稀释液平衡 2 min～5 min，调节 pH=9.5；
h) 2 mL底物显色液黑暗中孵育；
i) 50 mL灭菌双蒸水冲洗尼龙膜，终止反应。
7.1.2.5　斑点杂交检测
a) 剪取适合大小的尼龙膜0.7 mm×0.7 mm，划好格子，做好标记；
b) 膜上做好标记，分别吸取1.0 µL样品DNA点于膜上格子中央；
c) 将硝酸纤维素膜（NC膜，点样面朝上）放于已用变性液饱和的双层滤纸上变性10 min；
d) 再放于已用中和液饱和的双层滤纸上中和5 min；
e) NC膜室温干燥30 min，然后在80 ℃干烤2 h固定DNA；
f) 将NC膜放于预杂交液于68℃反应2 h，期间经常摇动NC膜；
g) 将探针于沸水中变性10 min，取出立即置于冰水浴中5 min；将变性的探针倒入预杂交液中，充分混匀即成杂交液，使NC膜在其中68 ℃杂交6 h以上（一般杂交过夜）；将膜取出放于直径11 cm平皿中，杂交液回收可反复使用；
h) 将NC膜放于洗液Ⅰ中于室温洗涤15 min，2 次，期间经常摇动NC膜；洗液Ⅱ中于68℃洗涤15 min，2 次，期间经常摇动NC膜；缓冲液Ⅰ中洗1 min；缓冲液Ⅱ中反应30 min，期间经常摇动NC膜；
i) 在20 ml缓冲液Ⅱ中加入4 μL抗Digoxiaenin抗体（碱性磷酸酶标记物，用之前离心5 min， 7826 g，将膜放于其中37 ℃浸泡30 min；洗膜：缓冲液Ⅰ洗涤；5 min×5次；
j) 缓冲液Ⅲ中反应浸泡2 min；在适当大小的平皿中加入10 mL缓冲液Ⅲ和100 μL（NBT和BCIP混合物），将NC膜放入其中显色30 min～1 h，注意显色时应避光保存；加入TE 缓冲液（pH＝ 8.0）终止显色反应。
7.2　结果判定
7.2.1　多重PCR结果分析条件设定
7.2.1.1　以ALV-A、ALV-J为阳性对照，凝胶电泳上阳性对照出现特异性目的条带为检测结果成立的前提条件，否则结果不成立。
7.2.1.2　凝胶电泳上未出现特异性目的条带判定为阴性。
7.2.1.3　凝胶电泳上出现特异性目的条带判定为阳性。
7.2.2　斑点杂交结果
7.2.2.1　以标准模式株ALV为阳性对照，SPF鸡肝脏、禽网状内皮组织增生症病毒（REV）、马立克氏病病毒（MDV）为阴性对照，阳性对照出现斑点和阴性对照不出现斑点为检测结果成立的前提条件，否则结果不成立。
7.2.2.2　点样膜上不出现斑点视为阴性。
7.2.2.3　尼龙膜上加样点处ALV-env探针出现清晰的斑点为阳性结果。
8　技术评价
8.1　多重PCR技术具有高特异性、高灵敏度、高效率、低成本的特点,适合大量样本的分析与鉴定。
8.2　斑点杂交检测技术的优点是杂交时一张膜上可同时检测多个样品，操作方便，耗时相对较短，并可做半定量分析；该方法无需特殊的仪器设备，试剂成本较低，阳性信号清晰。
8.3　两种技术结合可鉴别ALV-A和ALV-B的感染，同时可排除内源性禽白血病病毒的干扰，提高ALV-A/B和ALV-J诊断的准确率。

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