1　范围
本标准规定了水貂、狐和貉犬瘟热病毒等10种病毒性病原实时荧光PCR检测方法。
本标准所规定的实验室检测方法适用于水貂、狐和貉的犬瘟热病毒、细小病毒、冠状病毒、轮状病毒、星状病毒、阿留申病毒、杯状病毒、博卡病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒等10种病毒的荧光PCR检测方法，其他动物参考。
2　规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 19489  实验室生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫
GB/T 6682  分析实验室用水规格和实验方法
3　缩略语
荧光PCR         实时荧光聚合酶链式反应
Ct值            每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环圈数
DNA             脱氧核糖核酸
RNA             核糖核酸
Taq酶           Taq DNA 聚合酶
PBS             磷酸盐缓冲生理盐水
4　试剂和材料
4.1　荧光定量PCR检测仪及配套反应管（板）。
4.2　高速台式冷冻离心机（离心速度12000 r/min以上）。
4.3　混匀器。
4.4　恒温水浴锅。
4.5　冰箱（2 ℃～8 ℃和-20 ℃两种）。
4.6　微量移液器（0.5 L～10 L，5 L～20 L，20 L～200 L，200 L～1 000 L）及配套吸头。
4.7　1.5 mL离心管（无核酸酶）。
4.8　DNA\RNA核酸提取试剂等。
5　样品的采集与前处理
采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。
5.1　取样工具
5.1.1　棉拭子、剪刀、镊子、研钵、Eppendorf管。
5.1.2　所有上述取样工具必须经（121±2 ）℃，15 min高压灭菌并烘干或经160 ℃干烤2 h。
5.2　采样方法
5.2.1　拭子样品
a) 咽喉拭子采样，采样时要将拭子深入喉头及上腭来回刮3 次～5 次，取咽喉分泌液。然后将拭子插入到装有1.0 mL PBS无菌Eppendorf管中，编号备用。
b) 肛拭子采样，采样时要将拭子深入肛门回刮3 次～5 次，取排泄物。然后将拭子插入到装有1.0 mL PBS无菌Eppendorf管中，编号备用。
5.2.2　内脏或肌肉样品
用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0 g于研钵中充分研磨，再加5.0 mL PBS混匀，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。
5.2.3　血清或血浆
用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。
5.3　存放与运送
采集或处理的样本在2 ℃～8 ℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，须放置-70 ℃以下冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融3 次）。采集的样品密封后，采用保温设施加冰密封，尽快运送到实验室。
6　引物及探针
引物及探针见表1“荧光PCR方法的引物及探针”。
表1　荧光PCR方法的引物及探针
RNA病毒
犬瘟热病毒 F GCAAGCGAGGATTGAGGGTAT
 R GGCCTATGGGACACACTCAAA
 Probe FAM-CACCGACCATCCAGACGTTGCTCCT-BHQ
星状病毒 F TCCAGGCATTTGAGTATGCC
 R CCACATAATCCTGGGGGA
 Probe FAM-CGGGAGTCGTGGGAC-BHQ
冠状病毒 F TGGGAC(T)TATCCT(A)AAG(A) TGTGA
 R TAA(G)CACACAACNCCATCATC
 Probe FAM-CGGGAGTCGTGGGAC-BHQ
杯状病毒 F CTGACTTCAAATTTCATCTC
 R TGGGAATTAAGTCAGAGG
 Probe FAM-ATCTATGCTCACTCATGGATCTGTC-BHQ
轮状病毒 F TTTATAGATAATGTATGTATGGATG
 R CCAATTCTCAATGTAATCAG
 Probe FAM-AATAGCCAGAGAATCAGAACGAA- BHQ
细小病毒 F CGTCTACACAAGGGCCATTTA
 R CCATGTTGTCTACCAAATGCAT

表1　荧光PCR方法的引物及探针  （续）
细小病毒 Probe FAM-CGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCA-BHQ
DNA病毒
博卡病毒 F AGACGA CGCCTAGTTGTTTGGT
 R CAGTCCCTCCCAAGATACA CTTTG
 Probe FAM- AGGTTCCAC CCAATCCTGGTGCATTAAGC- BHQ
伪狂犬病毒 F GCCAACCCGCTCGTGCTC
 R CACGAACACGCAGTCGCAGTA
 Probe FAM-GGCAGGTGCTGGGACTCGGGC- BHQ
圆环病毒 F CTCCCAATCTCCCTATTTGAT
 R ATCTGTTCCTTTCGCTTTCTC
 Probe FAM-ACACCCCACCTACAGGGGTTCGC -BHQ
阿留申病毒 F ACCCTCCAGGTCAACTCTT
 R TTAGTAAATACACCAGGTTCTCC
 Probe FAM-TGAGTTCTCTTTTAACAGGATTCC-BHQ
7　操作方法
7.1　样本核酸DNA病毒的提取
在样本处理区进行。
7.1.1　在1.5 ml的eppendorf管中加入样品上清液200 ul，加入1 ml的DNA提取细胞裂解液，25 µL蛋白酶K混匀，56 ℃水浴2 h，期间不时轻微摇匀。加入10 µL RNA酶，37 ℃酶解1 h。
7.1.2　加入200 ul的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），室温放置10 min。
7.1.3　离心4 ℃、12000 r/min、15 min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。
7.1.4　加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10 min。
7.1.5　离心4 ℃、12000 r/min、15 min，用移液器小心吸去所有上清。
7.1.6　加1 ml 75 %乙醇洗一遍，离心4 ℃、8000 r/min、10 min，用移液器小心吸去所有上清，重复洗涤一次,在超净台中干燥5 min。
7.1.7　加入40μl～60μlTE溶解DNA，-20 ℃保存备用。
注1：可采用经验证的病毒DNA/RNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取DNA/RNA。
7.2　样本核酸RNA病毒的提取
所提取物为血清、血液、细胞培养液、鸡胚尿囊液和动物组织等中的病毒。提取时尽量在人少时进行，防止空气中RNA酶的污染。所用一切物品也应是无RNA酶的。
7.2.1　在1.5 ml的eppendorf管中加入样品上清液200ul，再加入TRIzol 1 ml，充分混匀，室温放置10 min。
7.2.2　加入200 ul的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），室温放置10 min。
7.2.3　离心4 ℃、13000 r/min、15 min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。
7.2.4　加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10 min。
7.2.5　离心4 ℃、13000 r/min、15 min，用枪小心吸去所有上清。
7.2.6　加1 ml75 %乙醇洗一遍，离心 4 ℃、8000 r/min、10 min，用枪小心吸去所有上清，重复此步骤,在超净台中干燥5 min。
7.2.7　加入40μl～60μlTE溶解RNA，-20 ℃保存备用。
注2：可采用经验证的病毒DNA/RNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取DNA/RNA。
7.3　扩增试剂准备
在反应混合物配制区进行，不区分DNA病毒和RNA病毒。
7.3.1　室温温浴PCR反应液，2000 r/min离心5 sec；
7.3.2　准备n个洁净经无核酸酶的PCR反应管，设所需PCR管数为n（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照）；
7.3.3　每个测试反应体系需要15 μL PCR反应液和0.3 μL Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15 μL，转移至样本处理区。
7.4　加样
在样品处理区进行，分别向上述PCR管中加入样本核酸提取步骤7.1中制备的DNA（或RNA）溶液各10μL，使总体积达25 μL。盖紧管盖后，1000 r/min离心30 sec。
7.5　荧光PCR反应---在检测区进行
将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录PCR管摆放顺序。反应参数设置：
7.5.1　DNA病毒：
a) 第一阶段，预变性50 ℃保持2 min；95 ℃保持3 min；
b) 第二阶段，95℃ 15 sec，60℃ 60 sec，共40个循环，最后40℃ 10 sec；荧光收集在第二阶段每次循环的延伸时进行。
7.5.2　RNA病毒：
a) 第一阶段，反转录45 ℃/15 min；95℃/3 min；
b) 第二阶段，95 ℃ 15 sec，60℃ 60 sec，共40个循环，最后40 ℃ 10 sec；荧光收集在第二阶段每次循环的延伸时进行。
8　结果判定
8.1　结果分析条件的设定 
阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准。对于多通道荧光PCR仪，选定FAM(465-510)检测通道读取检测结果，ABI仪器选择FAM无荧光淬灭基团。
8.2　质控标准
8.2.1　阴性对照选用TE溶液做模板。阴性对照无Ct/Cp值并且无扩增曲线。
8.2.2　阳性对照选用每种病毒引物基因阳性克隆质粒提取核酸做模板。阳性对照的Ct/Cp值应小于等于28，并出现典型的扩增曲线。
8.2.3　如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。
8.3　结果判定
8.3.1　阴性：无Ct/Cp值，且无特征性扩增曲线，表明样品为阴性。
8.3.2　阳性：Ct/Cp值≤30.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品为阳性。
8.3.3　Ct/Cp值大于30.0，且出现典型的扩增曲线的样品建议复验。复验仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。
9　废弃物处理
实验检测过程中产生的废弃物严格按照实验室生物安全管理的要求进行处理并做好记录。