向日葵种子纯度蛋白电泳检测技术_老木一支笔专业编制可行性研究分析报告_资金项目立项申请报告

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向日葵种子纯度蛋白电泳检测技术

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1　范围
本规程规定了蛋白质电泳的试剂配比、蛋白质提取、凝胶制备、电泳、染色、判别分析等技术要求。
本规程适用于向日葵品种及杂交种种子的纯度室内的快速鉴定。
2　规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 3543 种子检验技术规程
GB 20464 农作物种子标签通则
3　术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1　
杂交种
各种直接用于生产的杂交向日葵一代种子。
3.2　
品种纯度
品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。
3.3　
标准样品
能够充分代表种或品种特征特性的种子样品，或具备指定特征、特性样品。
4　原理
4.1　不同品种遗传组成不同，在种子形成时期合成的蛋白质不同。
4.1.1　不同的蛋白质由于分子大小、形状不同，在一定的pH条件下所带的电荷多少不同，因此在电场作用下，在凝胶中移动的快慢不同，通过电泳可以把不同的蛋白质区分开，近而区分不同的亲本和杂交种。
4.1.2　利用该电泳技术，杂交种具有不育系和恢复系的双亲谱带，双亲有差异蛋白谱带是杂交种纯度检测的关键位置。
4.2　蛋白谱带的命名方法：以点样孔为零点，在凝胶中部每个样品都含有的条带为50（图1），在0～50之间细分为50等份作为标尺，50以下的部分按该标尺进行区分，读取泳道内所有蛋白指纹所处位置的数值，记为蛋白质谱带名称。
5　仪器与试剂
5.1　仪器
单粒种子磨粉器，天平（感量0.0001 g，0.001 g），移液管(10 mL)，离心管（1.5 mL），离心管架，容量瓶（100 mL、500 mL、1000 mL），微量进样器（1μL～100 μL），离心机，双垂直板电泳槽，电泳仪，恒温箱，电冰箱，观片灯。
5.2　试剂
丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，冰醋酸，过硫酸铵，尿素，四甲基乙二胺(TEMED)，三氯乙酸，考马斯亮蓝R-250，十二烷基磺酸钠(SDS)，无水乙醇（所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水)。
6　溶液
6.1　2% SDS
称取2 g SDS倒入100 mL烧杯中，加入去离子水溶解，加去离子水定容至100 mL，转入试剂瓶，4 ℃贮存备用。
6.2　蛋白提取液
称取18 g尿素，加约50 mL去离子水溶解后加12 mL冰乙酸，3 mL 四甲基乙二胺，7.5 mL 2% SDS，加去离子水定容至100 mL，转入试剂瓶并加入0.05 g甲基绿，4 ℃贮存备用。
6.3　凝胶溶液
称取50 g丙烯酰胺、50 g尿素、1.0 g甲叉双丙烯酰胺，加去离子水溶解后加入15mL冰乙酸，0.10 g硫酸亚铁，加去离子水定容至500 mL，4 ℃贮存备用。
6.4　催化剂溶液
称取1.75 g过硫酸铵，加去离子水溶解并定容至50 mL，4 ℃短期贮存。
6.5　电极缓冲液
量取20 mL冰乙酸加水定容至1000 mL。
6.6　染色液
称取0.4 g考马斯亮蓝R-250，用25 mL无水乙醇溶解，倒入染色盘，加50 g～60 g三氯乙酸，加去离子水500 mL，搅匀。
7　操作程序
7.1　蛋白质提取
7.1.1　从送验样品中随机数取向日葵种子200 粒，将种子去壳后用单粒种子磨粉器压碎，放入1.5 mL离心管中，按向日葵种子与提取液质量体积比1:6加蛋白提取液、摇匀，25 ℃提取20 min，用离心机4000 g离心4 min，取上清液备用。
7.1.2　与标签值比较时，为了减少工作量，可以顺序测定50粒/次，将测定结果与标签值比较是否在允许误差范围内。
7.2　凝胶制备
将洗净晾干的玻璃板采用水平平板灌胶的方式组装玻璃板，用铁夹固定，取40 mL凝胶溶液于烧杯中，加65μL～80 μL催化剂溶液，迅速搅匀沿玻璃棒向玻璃板中倒满凝胶溶液，迅速插入样品梳，2 min～3 min聚合后将样品梳拔出，吸出样品槽中的水分，将玻璃板固定在电泳槽内。
7.3　点样
用微量移液器取离心后的样品上清液30 μL加入样品槽，每加一个样品后，用去离子水清洗移液器两次。
7.4　电泳
加样完毕后，加入2 %电极缓冲液，上槽电极缓冲液要没过矮玻璃板，下槽电极缓冲液要没过玻璃板，将电源线正极接上槽，负极接下槽。接通电源，85 mA稳流电泳2 h。
7.5　卸板、染色
倒出电极液，卸开电泳槽并用油灰刀取出胶片，置染色液中染色12 h左右。
7.6　电泳分析
7.6.1　取出凝胶洗净，在观片灯上观察蛋白质谱带，鉴定各泳道谱带的特征和一致性。
7.6.2　检测时以标准样品为参考，以亲本与杂交种的互补带为依据，分析杂粒和自交粒。
7.6.3　谱带与标准样品不一致的记为非本品种籽粒，非本品种籽粒谱带中仅在互补谱带位置缺少某一亲本的为自交粒。
8　结果计算
待整个供检样品电泳结束后，鉴定凝胶胶片上电泳谱带的一致性，计数供检样品粒数（N）和非本品种粒数（M），并按式计算电泳测定值X %（保留一位小数）。
X（%）=（N - M）/N×100
9　结果报告
参照GB/T 3543，写明对照样品名称，检测粒数，纯度%。对送样样品的检验需注明：“结果仅对样品负责”。监督检验时，需注明：“结果对种子批负责”。

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