鸡J亚群白血病实验室诊断技术_老木一支笔专业编制可行性研究分析报告_资金项目立项申请报告

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鸡J亚群白血病实验室诊断技术

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1　范围
本标准规定了我省针对ALV-J的检测诊断方法。
本标准适用于判断鸡群是否患J亚群白血病。
2　术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
2.1　
禽白血病病毒J亚群 Avian Leukosis Virus Subgroup J . ALV-J
ALV-J属反转录病毒科甲型反转录病毒属，是单股正链RNA病毒。ALV-J主要特点是引起多种禽类免疫抑制和髓细胞性白血病发生，对养鸡业威胁巨大。
2.2　
抗原/抗体检测
通过标准的酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测ALV-J的抗原/抗体。应用指定的商品化ALV-J抗原/抗体检测试剂盒，用血清检测ALV-J抗体，用棉拭子检测ALV-J群特异性抗原（p27）具体实验步骤参照GB/T 26436。抗体及p27均呈阳性，或二者之一呈阳性，可怀疑ALV-J感染。
2.3　
PCR
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)。
2.4　
RT-PCR
反转录-聚合酶链反应（reverse transcription PCR，RT-PCR）。
3　材料与试剂
3.1　常规使用的ELISA抗原/抗体检测试剂盒 (IDEXX)。
3.2　常规使用的商品化的RNA提取试剂盒。
3.3　常规使用的商品化的RNA反转录试剂盒。
3.4　各检测方法所需的试剂。
3.4.1　PBS缓冲液见附录A中A.1。
3.4.2　灭菌水。
3.4.3　蒸馏水。
3.4.4　细胞生长培养基见附录A中A.2。
3.4.5　细胞维持培养基见附录A中A.3。
除另有规定外，所有化学试剂均为分析纯。
4　仪器与设备
4.1　全自动高温高压灭菌锅 (温度范围：105-134℃；额定压力：0.23Mpa)。
4.2　低速离心机。
4.3　PCR仪。
4.4　二氧化碳恒温细胞培养箱。
4.5　液氮储存罐。
4.6　研磨器。
4.7　手术剪。
4.8　各量程移液枪。
4.9　超低温冰箱。
4.10　酶标仪。
4.11　分光光度计
5　抽样
5.1　样品采集
5.1.1　组织样品的采集
按1 %的比例，随机选取疑似J亚群禽白血病病鸡，用无菌手术剪分离肾脏、肝脏、脾脏等所需脏器100 mg 分装于1 mL 储存管内，并及时冻存于-80 ℃冰箱或液氮罐内备用。
5.1.2　血液样品的采集
用2.5 mL无菌注射器于翅下静脉或颈静脉抽取1 mL左右的静脉血，放入编号离心管内，倾斜静置，待血液分离出血清后吸取血清于编号的离心管内，储存于-20 ℃冰箱备用。
5.1.3　泄殖腔棉拭子的采集
用无菌棉签插入泄殖腔内，擦拭后将棉签放入装有1 mL PBS缓冲液的离心管内，储存于-20 ℃冰箱备用。
5.2　样品运输与存放
采集的样品应放入冻存管并放入冰盒内运输，然后上述要求及时放入液氮罐或-80 ℃冰箱或-20 ℃冰箱储存。
6　操作方法
6.1　方法
6.1.1　抗原/抗体检测
抗原/抗体检测是采用美国IDEXX 公司的ELISA检测试剂盒检测。
6.1.1.1　样品处理
检测样品前，棉拭子应反复冻融2 次～3 次，4 ℃，1006.2×g （3000转）离心2 min～3 min，吸取上清。血清样品于室温融化， 500 倍稀释，用于检测。
6.1.1.2　操作步骤
按照试剂盒提供的检测步骤操作。
6.1.1.3　结果判定
只要p27抗原和ALV-J抗体其中之一为阳性，需要进行下一步检测。
6.1.2　RT-PCR检测
通过对疑似病例组织RNA提取，反转录为cDNA作为模板进行特异性PCR检测。
6.1.2.1　RNA及cDNA提取
将冻存于液氮罐内的组织用商品化试剂盒提取RNA，用分光光度计测浓度后用商品化试剂盒反转录成cDNA。RNA储存于-80 ℃冰箱，cDNA储存于-20 ℃冰箱。
6.1.2.2　操作步骤
先完成RNA提取，具体操作按照试剂盒提供的步骤即可，测定浓度，然后将RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，利用ALV-J gp85片段的特异性扩增进行PCR扩增，扩增产物于120 V电压，1 %琼脂糖凝胶电泳检测。剩余的RNA保存于-80 ℃冰箱，cDNA保存于-20 ℃冰箱。具体反应条件见附录B。
6.1.2.3　结果判定
琼脂糖凝胶电泳中出现特异的545 bp的片段条带时，进行下一步检测。
6.1.3　病毒分离
6.1.3.1　DF-1细胞传代培养
取生长状态良好的DF-1细胞传代并用生长培养基培养至少4 小时，待细胞密度达到60 %～70 %后用于病毒分离。
6.1.3.2　组织研磨液制备
采用鸡肝脏/肾脏/脾与DMEM培养液充分混合、研磨后，作为病毒研磨液，并用超声波破碎90 循环，每个循环工作时间3 秒、间隔时间2 秒，重复两次，1006.2×g离心3 min后，上清用0.22μm的微孔滤器过滤除菌。
6.1.3.3　病毒液感作DF-1细胞
在二氧化碳培养箱培养了至少4 h的DF-1细胞倒掉生长培养基，将1mL组织滤液注入培养瓶/培养板内，作用于DF-1细胞，将细胞放在二氧化碳培养箱内作用1h后更换细胞维持培养基，培养至少7 天。
6.1.3.4　p27抗原检测
采用美国IDEXX 公司的ELISA检测试剂盒检测
6.1.3.5　结果判定
p27抗原阳性，可判定为ALV-J感染。
6.1.4　结果诊断
RT-PCR及病毒分离时DF-1细胞上清p27检测结果均为阳性时，可诊断为ALV-J感染。

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