高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株RT-PCR鉴别检测技术_老木一支笔专业编制可行性研究分析报告_资金项目立项申请报告

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株RT-PCR鉴别检测技术

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1　范围
本标准规定了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的RT-PCR鉴别检测技术的操作要求。
本标准适用于高致病性及经典猪繁殖与呼吸综合征的实验室诊断、监测和流行病学调查等。
2　实验室生物安全要求
实验室必须为生物安全Ⅱ级（BSL-2级）及以上实验室。
3　规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫
4　术语与定义
下列术语与定义适用于本标准。
4.1　
PCR
聚合酶链式反应。
4.2　
SDS
十二烷基硫酸钠。
5　仪器设备和试剂
5.1　仪器设备
5.1.1　微量移液器（最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL），带滤芯的枪头。
5.1.2　20000r/min低温高速离心机。
5.1.3　电热恒温水槽。
5.1.4　稳流稳压电泳仪。
5.1.5　水平电泳槽。
5.1.6　凝胶成像系统。
5.1.7　紫外透射反射分析仪。
5.1.8　电磁炉。
5.1.9　烧杯（1000 mL）。
5.1.10　电子天平精度为：0.001 g。
5.1.11　PCR扩增仪。
5.1.12　组织匀浆器或研钵。
5.1.13　-20 ℃冰柜。
5.1.14　2 ℃～8 ℃冰箱。
5.2　试剂
除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。
5.2.1　Trizol。
5.2.2　氯仿。
5.2.3　75%乙醇。
5.2.4　异丙醇。
5.2.5　AMV反转录酶（200 U/μL）。
5.2.6　RNA酶抑制剂（40 U/μL）。
5.2.7　Taq DNA聚合酶（5 U/μL）。
5.2.8　1.0 %琼脂糖凝胶：见附录A.1。
5.2.9　50×TAE缓冲液：见附录A.2.1和A.2.2。
5.2.10　焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌双蒸水：见附录A.3。
5.2.11　DNA分子量标准DL2000。
5.2.12　超纯水：符合GB/T 6682，三级。
5.2.13　引物：
上游引物P1:5-AAAGAYCAGATGGAGGAG-3；
下游引物P2:5-TRATGGCTTGAGCTGAG-3；斜体代表兼并碱基；
经典毒株扩增片段长度大小为766 bp，高致病性毒株扩增基因片段大小为676 bp。
6　操作程序
6.1　样品的采集和处理
6.1.1　样品的采集
临床上猪的脾、肺、淋巴结、血液等，置于-20 ℃冰柜或液氮中保存。
6.1.2　样品的处理
6.1.2.1　取猪的脾、肺、淋巴结等组织约5 g于研钵中，用剪刀剪碎，加入2 mL PBS缓冲液，研磨；血液3000 r/min离心5 min，分离血清。
6.1.2.2　阳性对照处理：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的疫苗株和经典毒株的疫苗株。
6.1.2.3　阴性对照处理：灭菌双蒸水。
6.2　RNA的提取–Trizol法
6.2.1　向处理好的300 μL组织样品或血清中加入800 μL Trizol，重复吹打以裂解细胞（或者剧烈振荡），冰上放置10 min～25 min。
6.2.2　加入氯仿200 μL，用力振荡30 s，室温放置5 min。
6.2.3　4 ℃，12000 r/min离心15 min，吸取上层液体500 μL于1.5 mL EP管中。
6.2.4　加入1.0 mL异丙醇，-20 ℃沉淀RNA至少1 h。
6.2.5　4 ℃ 12000 r/min离心10 min，弃上清，用75 %的乙醇洗涤沉淀，12000 r/min离心5 min，彻底弃去上清，自然条件下干燥沉淀，溶于50 μL DEPC处理的灭菌双蒸水中，-20 ℃贮存，备用。也可选择市售商品化RNA提取试剂盒，完成RNA的提取。
6.2.6　试验中同时设立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的疫苗株和经典毒株的疫苗株作为阳性对照和灭菌双蒸水作为阴性对照。
6.3　反转录
反转录20 μL体系
序号体系组成体系含量
1 RNA 5 μL
2 2.5 mmol/L反转录引物（下游引物） 1 μL
3 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL
70 ℃保温5 min，冰浴2 min。继续加入。
反转录体系
序号体系组成体系含量
1 5×反转录酶反应缓冲液 4 μL
2 AMV反转录酶 0.8 μL
3 RNA酶抑制剂 0.5 μL
4 灭菌DEPC水 6.7 μL
瞬时离心后，42 ℃处理45 min，95 ℃灭活10 min。取出后直接进行PCR，或置于-20 ℃保存备用。
6.4　PCR
PCR为50 μL体系，按表3中1～7的循序配制。
PCR为50 μL体系
序号体系组成体系含量
1 灭菌双蒸水 37.5 μL
2 反转录产物 4 μL
3 10 mmol/L上游引物 0.5 μL
4 10 mmol/L下游引物 0.5 μL
5 10×PCR Buffer 5 μL
6 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL
7 Taq DNA聚合酶 0.5 μL
首先加入灭菌双蒸水，然后按顺序逐一加入上述成分，每次要加入到液面下。全部加完后，混悬，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。循环参数为95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循环30次，72 ℃延伸10 min结束。
也可选择市售商品化RT-PCR试剂盒，完成反转录聚合酶链式反应。
6.5　琼脂糖凝胶电泳
6.5.1　制备1.0 %琼脂糖凝胶板，见附录A.1。
6.5.2　取5 μL PCR产物与0.5 μL加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。
6.5.3　加入分子量标准。
6.5.4　盖好电泳仪，插好电极，5 V/cm电压电泳，30 min～40 min。
6.5.5　用凝胶成像仪观察、扫描图片存档。
6.5.6　用分子量标准比较判断PCR片段大小。
7　结果判定
7.1　在阳性对照出现766 bp或者676 bp扩增带、阴性对照无此扩增带时，实验结果成立（参见附录A.4）。
被检样品扩增片段长度大小为766 bp则判定为经典猪繁殖与呼吸综合征病毒株，扩增基因片段大小为676 bp则判定为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株。

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