梧桐花黄酮提取及生物活性评价技术_老木一支笔专业编制可行性研究分析报告_资金项目立项申请报告

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梧桐花黄酮提取及生物活性评价技术

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1　范围
本规范规定了梧桐花黄酮的提取及其生物活性评价的术语和定义、试剂或材料、仪器设备、梧桐花黄酮的提取、黄酮含量的测定、生物活性评价等标准。
本规范适用于梧桐花作为动物用免疫佐剂和免疫增强剂的相关产品。
2　规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 603　化学试剂　试验方法中所用制剂及制品的制备
GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 24863—2010　畜禽细胞体外培养与冷冻保存技术规程
3　术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1　
抑菌圈　bacterial inhibition ring
是利用待测药物在琼脂平板中扩散使其周围的细菌生长受到抑制而形成透明圈，即抑菌圈。根据抑菌圈大小判定待测药物抑菌效价。
3.2　
最小抑菌浓度　minimum inhibitory concentration，MIC
在特定环境下孵育24 h，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度，即最小抑菌浓度，用于定量测定体外抗菌活性。
3.3　
细菌毒力　bacterial virulence
表示病原体致病能力的强弱，是菌体对宿主体表的吸附，向体内侵入，在体内定居、生长和繁殖，向周围组织的扩展蔓延，对宿主防御功能的抵抗，以及产生损害宿主的毒素等一系列能力的总和。
3.4　
组织细胞半数感染剂量　50% tissue culture infective dose，TCID50
又称50 %组织细胞感染量，即指能在半数细胞培养板或试管内引起细胞病变（cytopathic effect，CPE）的病毒量。
4　试剂或材料
4.1　9日龄SPF鸡胚。
4.2　DMEM细胞培养液。
4.3　胰蛋白酶。
4.4　胎牛血清。
4.5　芦丁标准品。
4.6　无水乙醇、正丁醇。
4.7　去离子水。
4.8　生理盐水。
4.9　营养琼脂培养基。
4.10　营养肉汤培养基。
5　仪器设备
5.1　索氏提取器。
5.2　旋转蒸发仪。
5.3　电子天平
5.4　120目筛。
5.5　恒温振荡培养箱。
5.6　96孔细胞培养板。
5.7　分光光度计。
5.8　恒温干燥箱。
5.9　恒温培养箱。
5.10　灭菌锅。
5.11　二氧化碳培养箱。
5.12　打孔器（7 mm孔径）。
5.13　试管（10 mL体积）。
5.14　烧杯（1000 mL体积）。
5.15　光学显微镜（目镜10×，物镜40×）。
6　梧桐花黄酮的提取
6.1　将采集的梧桐花置于干燥箱中60 ℃干燥，粉碎，过120目筛。
6.2　称取1 kg梧桐花粉末（分为若干份）置于索氏提取器中，用12倍60 %乙醇回流提取3次，每次2 h。
6.3　合并滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩，得乙醇粗提物。
6.4　取乙醇粗提物用6倍正丁醇溶解萃取，萃取液用旋转蒸发仪减压浓缩，即为梧桐花总黄酮提取物。
7　梧桐花黄酮含量的测定
7.1　精确称取芦丁标准品30 mg，用95 %乙醇溶解，定容于100 mL容量瓶中，摇匀即得浓度为0.3 mg/mL的芦丁标准储备液。
7.2　经过标准液显色后用1cm比色皿在波长400 nm～700 nm区间进行紫外扫描，确定在510 nm处最大吸收波长。
7.3　分别吸取上述芦丁储备液0、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL于6个25 mL的量瓶中，加入5 %的NaNO2溶液1.0 mL，摇匀、静置5 min。
7.4　加入10 %的Al(NO3)3溶液1.0 mL，摇匀、静置5 min。
7.5　加入1.00 mol/L的NaOH溶液5.0 mL并摇匀，用95 %乙醇溶液定容，静置10 min。
7.6　于波长510 nm下测定吸光度，试剂空白为参比液，绘制标准曲线。采用最小二乘法进行回归分析，得回归方程A＝0.01377c＋0.0012（R2=0.9995，A为吸光值，c为梧桐花总黄酮含量）。
7.7　以芦丁对照品溶液为标样，采用上述亚硝酸钠-三氯化铝比色法，在510 nm处测定其吸光值。
7.8　总黄酮提取率（%）=（黄酮类化合物总质量/干物料质量）100 %。
8　生物活性评价
8.1　抑菌活性评价
8.1.1　菌悬液的制备
8.1.1.1　原菌液制备
将细菌接种到营养肉汤培养基（配制方法见附录A.1）中，于37 ℃培养箱中培养24 h后作为原菌液。
8.1.1.2　菌悬液制备
将各原菌液配制成含菌数为106 CFU～107 CFU（菌落形成单位）/mL的菌悬液备用。
8.1.2　抑菌试验（打孔法）
8.1.2.1　配制营养琼脂（Nutrient Agar）平板（配制方法见附录A.2），琼脂厚度为4 mm，分别吸取100 μL菌悬液，均匀涂布于培养基表面。
8.1.2.2　用直径7 mm的打孔器在每个平板上打6个孔，其中5个孔内加入100 μL梧桐花总黄酮提取物，另外1个孔加入等量灭菌生理盐水，每种菌涂布5个板作为重复，置37 ℃温箱中培养24 h，观察细菌生长情况。
8.1.2.3　记录抑菌圈直径，并求平均值。
8.1.3　最小抑菌浓度（MIC）的测定
8.1.3.1　取无菌试管30支，分成3组，每组10支，每种供试菌做三组平行。
8.1.3.2　将提取的黄酮原液浓度稀释至25 mg/mL作为抑菌试验的起始浓度。前3组每管加营养肉汤培养基2.5 mL，第1管加2.5 mL试验药液混匀后，依次进行2倍稀释，使1～9管药液浓度分别为12.5、6.25、3.125、1.56、0.781、0.391、0.195、0.097、0.049。除第10管外其他各管每管加菌液125 μL，充分混匀后均放入恒温振荡培养箱中，37 ℃振荡培养24 h，观察试验结果。
8.1.3.3　对照管第10管无细菌生长，试验方为有效。以抑制试验菌生长的药液最高稀释度为该药物对该试验菌的抗菌效价，以其相应药物浓度为最低抑菌浓度。
8.2　梧桐花总黄酮体外抗病毒试验
8.2.1　梧桐花总黄酮提取物对鸡胚成纤维细胞（CEF）的最大无毒浓度（TCO）测定
梧桐花总黄酮用维持液配制成25 mg/mL溶液，微孔滤膜滤过，二倍系列稀释后，加入培养在96孔细胞板上的传代至第三代的CEF单层细胞（原代CEF细胞由9日龄SPF鸡胚制备），每孔100 μL，每浓度重复5孔，同时设正常细胞对照。在37 ℃，5 % CO2条件下培养，每隔12 h显微镜下观察细胞，记录病变情况（与正常细胞相比有无退变、变形和脱落）。连续观察7 d，记录梧桐花总黄酮提取物对CEF的最大无毒浓度（TCO）。CEF细胞的培养符合GB/T 24863—2010的规定。
8.2.2　新城疫病毒（NDV）、传染性法氏囊病毒（IBDV）的组织细胞半数感染量（TCID50）测定
待CEF细胞长成单层后，分别接种稀释度为10-1至10-11梯度稀释的病毒液，100 μL/孔，每个稀释度接种6个孔，培养6 d，每天观察细胞病变（CPE）情况，按Reed-Muench公式计算细胞半数感染量（TCID50）。
8.2.3梧桐花总黄酮对新城疫病毒（NDV）和传染性法氏囊病毒（IBDV）在细胞内增殖的抑制作用检测
8.2.2.1　待CEF刚长成单层细胞时，将0.1 mL含100 TCID50的NDV和IBDV接种于96孔细胞培养板中，每孔0.1 mL，置于37 ℃温箱2 h。
8.2.2.2　梧桐花总黄酮用维持液做2倍倍比稀释后，作为药液备用。
8.2.2.3　病毒吸附后，取出温箱的细胞板，弃上清，并用维持液洗2次，再加入已稀释的各组药液，每孔0.1 mL，每个试验组设置5个重复，同时设细胞对照组、病毒对照组、以及金刚烷胺对照组。
8.2.2.4　每日观察1次，记录CPE情况，当病毒对照组达“+++++”时（注“-”表示无细胞病变；“+”表示20 %细胞有病变；“++”表示40 %细胞有病变；“+++”表示60 %细胞有病变；“++++”表示80 %细胞有病变；“+++++”表示100 %细胞有病变），终止实验，记录实验结果。
8.2.3　梧桐花总黄酮对新城疫病毒（NDV）和传染性法氏囊病毒（IBDV）的直接灭活作用检测
8.2.3.1　将预先稀释的药液与100 TCID50/0.1 mL的IBDV、NDV等体积混合，在37 ℃温箱内作用2 h。
8.2.3.2　接种在长有CEF的96孔细胞培养板里，每孔0.2 mL，每组5个重复，同时设细胞对照组、病毒对照组以及金刚烷胺对照组。
8.2.3.3　再放入温箱里作用2h。取出后倒掉其中液体，用维持液洗2次，每孔加维持液0.1 mL，置于37 ℃，5 % CO2温箱中培养，每天观察CPE，当病毒对照组的CPE达到“+++++”时，终止实验，记录实验结果。

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